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期刊年卷：The American Journal of Human Genetics 109, 1458–1471

发表时间：2022年8月

影响因子：11.025

DOI: https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2022.06.007

实验分析方法： 靶向X染色体测序或全外显子组测序，RNAi介导的基因沉默，免疫荧光染色

研究背景以及结果

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尽管X染色体有很多在男性睾丸中特异表达的基因，目前对于X染色体在生精过程的作用仍然知之甚少。只有3个X连锁基因（AR，TEX11以及USP26 ）明确报道参与男性精子的生成，并且只能解释大约1%的特发性无精子症或者少精子症。

本文的研究对象为4个独立队列的2354名无精子症/隐匿精子症患者，以209名精子数量以及质量正常的人群作为对照，发掘X染色体上与男性不育相关的潜在基因。

结果如下

除已知的基因外，最新发现了X染色体上存在21个与无精子症/隐匿精子症高度相关的突变基因，以及34个中度相关的突变基因。其中RBBP7 在10名（4个不同队列）不育男性中均发生了致病变异，是突变频率最高的基因，同时在果蝇中证明该基因具有维持生殖干细胞的功能，被认为是最有研究价值的男性不育的X连锁基因之一。

研究思路

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该研究中的男性不育患者，入组前均排除了获得性因素（化疗，睾丸炎，睾丸扭转等）以及已知的遗传学异常（核型异常以及Y染色体AZF缺失）。

随后，基于4个独立研究队列的2354不育患者(BCN =129, GEMINI =903, MERGE=1056，NIJ/NCL =266)的靶向性X染色体测序或WES测序数据，将X染色体上的蛋白质编码基因进行了分析筛选。

排除标准

杂合性以及/或测序深度<10的变异位点，正常人群中存在的功能缺失LoF位点，多态性位点（gnomAD数据库中人群频率>1%）等

保留标准

至少在两名男性不育患者中出现的非同义突变以及剪切位点，经过CADD11，PolyPhen12或MutationTaster等软件预测为致病性的位点

经过筛选后，共剩余377个候选基因，除了15个基因前期研究可能与无精子症或少精子症有关，其中362个基因并未报道和男性不育相关。

为了评估这些候选基因与男性不育表型之间相关性，作者定义了一个评分标准，内容包括：

基因对应的mRNA以及蛋白质在睾丸中的表达情况；

动物模型中是否存在相同或者类似的不育表型；

是否有体外实验或者其他证据支持候选基因参与精子发生(例如在减数分裂、参与DNA修复等相关过程，影响生殖细胞分化/增殖等)；

是否与其他不育相关基因互相作用；

突变是否与其他男性生殖系统异常相关（如小睾丸，隐睾等）。

通过上述综合比较，最终确认X染色体上存在21个与无精子症/隐匿精子症高度相关的基因（score>5分），包括APEX2，CMC4，CUL4B，DCAF12L2，FAM9A，FANCB，FATE1，KIF4A，MSL3，NONO，PASD1，POLA1 , RBBP7，SCML1，SCML2，TAF1，TAF9B，THOC2, TIMP1，USP9X以及ZMYM3等基因，上述结果在另一个319位不育队列中得到了验证。同时，中度相关的候选基因有34个（score=3~4)，相关性低的基因有236个（score≤2）。

图1  大队列筛选X染色体上与男性不育相关的候选基因

研究结论

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21个与男性不育相关的候选基因

21个相关性最强的候选基因，主要在细胞增殖/分化、减数分裂细胞周期、DNA修复、染色质重塑和细胞通信中发挥作用。上述结论来自于模型生物的验证，已有发表文献的支持证据或者对应的表达量数据。其中RBBP7 在四个队列中10位早期生精阻滞的不育男性中均检测到变异，是突变频率最高的基因，果蝇模型验证也证实RBBP7与生殖干细胞的发育相关，与RBBP7类似，FANCB缺失会导致其表现出原始生殖细胞的进行性丢失，ZMYM3、KIF4A和SCML2参与精子减数分裂过程，这些基因的变异均会造成雄性小鼠不育。

图2 21个与男性不育相关性强的候选基因

B, Barcelona队列; B, Barcelona Replication队列; M, MERGE队列; M, MERGE Replication队列; G, GEMINI队列; N, Nijmegen/Newcastle队列; Azoo无精子症; Crypto隐匿精子症; SCO唯支持细胞; iSCO不完全SCO; SGA精原细胞停滞; iSGA不完全SGA; iSCA不完全精母细胞停滞; MeiA减数分裂停滞; MatA精子成熟停滞; Hypo精子生成功能低下; Mmu小鼠; Dme果蝇; Cel秀丽线虫

RBBP7 影响果蝇生殖干细胞的维持与分化

果蝇Cal1-p55基因（RBBP7的同源基因）经过RNAi沉默后，果蝇睾丸体积显著缩少（图B），通过生殖干细胞(germline stem cells ,GSCs)标记物Vasa以及dBigH1检测，发现突变型果蝇中富集在睾丸顶端的GCSs细胞较野生型明显减少（图C，D）。

鉴于Caf1-p55和RBBP7在蛋白质水平上的高度相似性(94%)，该结果强烈支持RBBP7极有可能在人类精子生成中发挥作用，该基因的变异可能会导致无精子症或者少精子症。

图3 果蝇Caf1-p55 影响生殖干细胞的维持与分化

候选基因的蛋白质互作预测

通过生物信息学预测蛋白质相互作用，结果证明X染色体上与无精子症/隐匿精子症强烈相关的21个基因编码的蛋白质大部分可以显著地富集(p value =0.0123)，说明这些蛋白质之间至少部分地存在生物联系，可能一起协同参与精子的发生过程。

图4 候选基因的蛋白质互作预测

研究意义

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本文提供了男性不育研究中最大规模的X染色体连锁基因组数据，通过2354位无精子症/少精子症的大队列研究，发现了21个未被报道可能造成生精功能障碍的新基因，其中80%以上的基因在不同的独立队列中被发现，其中RBBP7被认为是最有可能与男性生精相关的候选基因，该研究减少了X染色体基因在男性不育方面的空白，有助于推动未来男性不育基因诊断的发展。