成都三代试管费用（【综述】男性不育相关代谢组学研究进展）

admin 3年前 (2022-10-25) 试管健康资讯 74 0

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作者：

吴华1 王晖2 钱云1

作者单位：

1南京医科大学第二附属医院生殖医学科210011；2 南京医科大学基础医学院组织胚胎学系，南京医科大学生殖医学国家重点实验室211166

通信作者：

钱云，Email：qianyun@njmu.edu.cn，电话：+86-15366136559

本文刊登于《中华生殖与避孕杂志》

2020, 40(10): 864-870.

摘要

随着生活环境改变和社会压力增加，男性精液质量逐步下降，男性不育症发病率逐年上升，愈来愈受到人们关注。精液分析是目前诊断男性不育症的首选检查，但无法明确与男性不育症相关的精液代谢改变及其相关机制，且临床上尚存在部分不育症患者表现出正常的精液分析结果。代谢组学的出现有希望弥补精液分析的这些不足。代谢组学通过对样本中小分子代谢产物进行定性和定量分析，寻找疾病发生发展的生物标志物，为疾病诊疗提供新方法。近年来，各国学者利用代谢组学对不育男性的血清、精浆等样本进行研究，发现了多种可能与男性不育症相关的生物标志物，涉及氧化应激、能量代谢、信号转导中的多种通路。本文就近年来代谢组学在无精子症、少精子症、弱精子症、畸形精子症及不明原因男性不育症中的研究进展作一综述，以期为不育症的临床诊疗提供新思路。

【关键词】男性不育症；代谢组学；代谢紊乱；生物标志物；潜在机制

基金项目：国家自然科学基金（81774075）

DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20191105-00498

近年来，随着生活环境改变和社会压力增加，不孕症发病率逐年上升，全球约有1.86亿人受其困扰，其中男性因素几乎占据不孕症病因的一半，越来越受到重视［1］。导致男性不育的因素主要有性功能障碍、精液异常以及不明原因不育等［2］，以精液异常为首要原因。精液常规分析是临床上最常用的检查方式，然而，精液采集对部分患者来说相对困难，且该分析无法明确精液异常导致不育的潜在机制，临床上尚存在部分不育症患者表现出正常的精液分析结果。代谢组学的出现有希望弥补精液分析的这些不足，可能发现和识别这部分不育患者的发病机制，并且可检测血清、尿液、精浆甚至睾丸组织等多种生物样本，逐渐被应用于男性不育症的研究中（如图1示）。研究显示，代谢组学筛出的产物如氨基酸、脂质、糖类等参与重要生理过程，通过氧化应激、能量代谢、信号转导等过程影响精子发生和成熟、质膜保护、精子运动等重要生物事件，是诊断男性不育症的潜在生物标志物［3］。由于效率高、损伤小、样本多样化且能够检测出精液常规分析未能发现的异常，利用代谢组学技术寻找相关生物标志物有望推动男性不育症的无创诊断，具有广阔的应用前景。笔者就代谢组学在无精子症、少精子症、弱精子症、畸形精子症及不明原因男性不育症中的应用作一综述，从代谢组学角度探讨男性不育症的发病机制及诊断、治疗进展，以期为男性不育症的临床诊疗提供新视角。

一.

代谢组学和男性不育症

代谢组学是近年来的一门新兴学科，当机体代谢发生紊乱时，体液、组织、细胞中的代谢物均会发生相应变化，通过检测这些代谢物变化可发现与疾病相关的代谢问题。代谢组学的飞速发展离不开先进的代谢组学分析技术，如气相色谱-质谱联用技术GC-MS、液相色谱-质谱联用技术LC-MS、高效液相色谱技术HPLC、核磁共振波谱分析技术NMRS等。这些技术已被逐渐应用于男性不育症的研究并取得了一定成果。目前代谢组学在男性不育症领域的研究集中于发病机制探索、生物标志物筛选、疾病早期诊断等方面，具有广阔的应用前景。

男性不育症病因复杂，以精液异常为首要原因，精液包括精子和精浆，精浆中含多种氨基酸、酶、糖类、脂质等，对精子的生成和发育至关重要［4］。精液常规检查是诊断不育症的重要依据，临床上常见的精液分析结果可分为无精子症、少精子症、弱精子症、畸形精子症等。此外，临床上部分不育症患者精液常规无异常，且排除女方因素及男方内分泌紊乱、精索静脉曲张、生殖道感染、先天性疾病等，称之为不明原因男性不育症UMI。UMI患者的精液异常不能在常规精液分析中显示，而代谢组学研究发现，UMI患者精浆中的多种代谢物较健康可育男性存在明显异常［5-8］，这为UMI的临床诊断及治疗开辟了新的道路。除了应用较多的精浆样本，血清、尿液以及睾丸组织等样本也已逐步应用于男性不育症的代谢组学研究中。

二.

精液异常及UMI患者的代谢组学分析

1. 无精子症相关代谢组学分析：无精子症是男性不育症中较为严重的一种类型，通常指两次以上精液涂片镜检找不到精子，且离心沉淀物镜检亦无精子，同时排除无射精和逆行射精［9］。按输精管道是否通畅可将无精子症分为梗阻性无精子症OA和非梗阻性无精子症NOA两大类。

目前无精子症的确诊多依赖于睾丸或附睾活检，操作有创且因取材有限故精子获取率不高，临床上急需一种更安全高效的方法诊断无精子症，对样本中分子标志物的检查提供了一种非侵入性的诊断方法。Hamamah等［10］采用氢质子磁共振波谱对无精子症者精浆进行比对分析，数据显示NOA组较OA组胆碱/柠檬酸盐、胆碱/乳酸和甘磷酸胆碱/胆碱比率增加；对不同病因NOA男性的睾丸组织进行的分析显示，输精管切除组较唯支持细胞综合征SCOS组磷酸胆碱浓度显著升高、牛磺酸浓度显著下降［11］，而牛磺酸存在于睾丸间质细胞、血管内皮细胞和其他间质细胞中［12］，具有较强的抗氧化保护作用；同时睾丸需要大量磷酸胆碱作为底物合成精子膜结构，其异常引起精子膜合成障碍。新近研究表明，有机酸、脂肪酸和糖代谢异常在NOA的发生中占据重要地位，如Liu等［13］报道NOA男性睾丸组织中草酸、花生四烯酸、羟基丁酸、果糖等数十种代谢物较OA组显著下降，表明其睾丸处于低代谢水平；同时该研究证实拉曼光谱可有效区分OA和NOA，有较高的敏感度（90%）和特异度（85.71%）。Zhang等［14］的研究显示，与健康对照组相比，NOA男性血清中异柠檬酸、牛磺酸等下调而油酸、乳酸、丙酮酸和次黄嘌呤等上调，主要富集于D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙酮酸代谢、柠檬酸循环和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢五条代谢通路。Gilany等［15］首次将代谢指纹分析用于预测NOA患者的精子发生情况，由于样本量小，其临床应用尚需进一步的研究及试验；同时该研究显示与睾丸穿刺阳性患者相比，TESE阴性患者的精浆处于极度氧化失衡状态，提示氧化应激可能是无精子症的发病机制之一。因此，精液检查初步诊断无精子症的患者可以进行血清和精液等的代谢组学检测来评估其生精功能，以减少创伤、减轻患者痛苦。

2. 弱精子症相关代谢组学分析：弱精子症指2次以上精液检查示前向运动精子（PR）<32%、PR+非前向运动精子（NP）<40%［9］。单独的常规精液分析不足以全面评估弱精子症男性的生殖功能，代谢组学可在一定程度上阐释弱精子症的可能机制。糖酵解是精子的重要能量来源，Xu等［3］的人精浆代谢组学分析显示，糖酵解代谢通路中的2-磷酸甘油酸在弱精子症组显著增加，且与精子畸形呈负相关。果糖是精浆中最丰富的糖类和精子的重要能量来源，动物实验发现高生育力组公牛的精浆果糖水平显著高于低生育力组，果糖是评估生育力的潜在生物标志物［16］；人体研究亦证实精浆果糖降低与精子运动力减弱有关［17］，体外培养液中添加果糖可显著改善人精子活力［18］。弱精子症患者精浆中氨基酸和脂质代谢亦存在紊乱，如Zhang等［19］对弱精子症和健康男性的精浆进行对比分析，发现牛磺酸、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸等氨基酸显著增加，而苯丙氨酸和酪氨酸水平显著降低，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路主要富集在胆碱代谢、三羧酸循环、胆固醇代谢等多条通路；同时作者还对差异代谢物进行受试者工作特征（ROC）曲线分析，结果显示ROC曲线下面积（AUC）为92.7%，对弱精子症发生具有较好的诊断效能。此外，弱精子症者精浆中油酸和棕榈酸水平以及人体必需氨基酸——花生四烯酸上升显著［20-21］，而精子中色氨酸、谷氨酰胺和乳酸等27种代谢物明显减少［22］，显著富集的通路有嘧啶代谢、牛磺酸和甘氨酸等氨基酸代谢、三羧酸循环。除了氨基酸代谢紊乱，氧化型胆固醇如5α-胆固醇和7-酮胆固醇在弱精子症患者精浆中升高，表明其精浆脂质代谢亦出现异常［19］。这些氨基酸和脂质作为氧化应激、能量代谢、信号转导过程中的重要分子，影响精子ATP产生、膜磷脂代谢等进而影响精子活力，是诊断弱精子症的潜在生物标志物，为研究弱精子症的潜在发病机制提供了线索。

3. 少精子症相关代谢组学分析：少精子症被定义为2次以上精液检查示精子浓度<15×106/mL［9］，仅用精子浓度定义少精子症虽直观却有一定片面性，代谢组学能更加全面地检测少精子症患者的代谢异常，发现其可能发病机制并为其治疗提供理论支持。研究表明，精浆、血清及尿液中氨基酸及其类似物、有机酸、嘌呤等代谢异常与少精子症发生相关［23-25］。Courant等［23］证实低精子浓度（<20×106/mL）组血清中亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸等多种氨基酸水平显著低于中高精子浓度组；另一项基于LC-MS的研究表明尿液中酰基肉碱、亮氨酰基脯氨酸和天冬氨酸的减少以及腺嘌呤和甲基黄嘌呤的增加与少精子症风险增加密切相关，尿液乙酰肉碱、肉碱C3：1和天冬氨酸的联合检测诊断少精子症的AUC为73%，具有一定诊断价值［24］。精浆中肉碱被认为与精子发生、成熟和代谢密切相关，左旋肉碱已被临床上用于不育症的治疗并取得一定疗效。此外，Gupta等［25］报道少精子症组精浆中柠檬酸盐、组氨酸、丙氨酸、甘磷酸胆碱较健康对照组显著下调，而酪氨酸和苯丙氨酸显著上调，柠檬酸盐、甘磷酸胆碱等联合检测预测少精子症的敏感度和特异度分别为95%、97.6%，AUC为96.8%，联合指标具有较高的预测价值。可见少精子症的发生可能与氨基酸及其衍生物、核苷酸等代谢改变相关，多种标志物联合检测辅助评估睾丸生精功能或将开拓少精子症无创诊断的新领域。

4. 畸形精子症相关代谢组学分析：WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第5版将正常形态精子百分率小于4%称为畸形精子症［9］，临床上许多畸形精子症患者常合并有少精子、弱精子等其他精液异常。精子形态分析具有一定主观性，染色方法和分析标准的不同亦会使得结果产生较大差异，因此常规精子形态分析具有一定片面性。Ma等［26］对畸形精子症患者血浆进行非靶向代谢组学分析，观察到其血浆中2-氨基丁酸、焦谷氨酸、柠檬酸盐、1，5-脱水山梨糖醇水平升高，而尿素和鸟氨酸较健康对照组显著下降，主要涉及糖代谢和多种氨基酸代谢通路。精浆核磁共振波普证实少弱畸形精子症组乳酸、柠檬酸盐、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸等较正常组显著降低，而酪氨酸则显著升高，偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）区分二者的敏感度为89.29%，特异度为93.55%［27］。少弱畸形精子症男性精浆中油酸、花生四烯酸等不饱和脂肪酸显著下调，且与精子畸形呈正相关，下调的左旋肉碱、乙酰左旋肉碱亦与精子数量、畸形呈正相关［3］。此外，花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）作为人体内源性大麻素系统的重要组成部分，因其在抗炎、抗氧化、精子获能中的关键作用而在生殖领域逐渐受到关注。Amoako等［28-29］的人精浆代谢组学分析显示，弱精子症、少弱畸形精子症男性精浆AEA及其类似物棕榈酰乙醇酰胺PEA和油酰乙醇胺OEA水平均显著下降，暴露于PEA和OEA后精子活力快速、显著提高。精子形态正常是完成受精的基础，形态异常将影响精子体内和体外受精，但精子畸形对胚胎质量、妊娠结局等的影响尚存在争议［30-32］。在变形过程中精子对能量需求增加，糖、脂质、蛋白质等代谢异常可能对精子变形产生不利影响。由此可见，代谢组学是研究畸形精子症的有力工具，为研究其发病机理、发现生物标志物提供依据。然而目前关于畸形精子症的代谢组学研究较少，相关结果还需进一步考证。

5. UMI相关代谢组学分析：常规精液分析可识别无精子症、弱精子症、少精子症和畸形精子症等异常，而UMI患者的“精液异常”不能在常规精液分析中显示，代谢组学的出现为UMI的诊断开辟了新道路。精浆抗氧化能力下降已被证明与UMI的发生相关，如代谢指纹图谱分析显示，UMI男性精浆中存在氧化和抗氧化失衡［33］；Lazzarino等［5］的研究表明，UMI男性精浆中抗坏血酸、α-生育酚明显减少而氧化损伤指标丙二醛和8-羟基脱氧鸟苷明显增加；4-羟基苯乙酸和色氨酸、甘氨酸等多种氨基酸在UMI患者的精浆中被发现显著减少［6］，主要富集于氮代谢、谷胱甘肽代谢等七条代谢通路。4-羟基苯乙酸是有效的抗氧化剂，而在UMI组其浓度下降，表明UMI患者精浆抗氧化能力下降，精子更易遭受氧化应激损害。精子能量代谢异常亦与UMI密切相关，如Jayaraman等［7］报道UMI组精浆中缬氨酸、赖氨酸、2-羟基异戊酸和果糖显著低于健康对照组，赖氨酸是区分UMI和健康对照的潜在生物标志物；精浆中果糖来源于精囊腺，是精子运动的重要能量来源，其减少可导致精子活力下降。UMI男性尿液中酰基肉碱、苏氨酸等氨基酸及其衍生物被发现减少［8］，富集通路包括酰基肉碱代谢、花生四烯酸代谢和核苷酸代谢等；同时ROC曲线分析显示白三烯E4、天冬氨酸、黄嘌呤核苷等的联合检测具有最高诊断效能（AUC为0.901，敏感度和特异度分别为85.7％和86.8％）。UMI患者常表现出正常的精液常规分析结果，故UMI的病因探讨一直是男性不育症的难点，而代谢组学检测出UMI患者精液中存在代谢指标上的异常改变，通路分析显示氧化应激损害、能量代谢异常等在其中起重要作用，因此代谢组学是攻克UMI发病机制难题的有利武器。

三

相关机制探讨

综上，各国学者运用代谢组学方法对精液异常相关不育症患者的精浆、血清等进行探索，发现其体内氨基酸、脂质、糖类、核苷酸等存在代谢紊乱。多种代谢物相互联系、相互转变、相互交汇，主要富集于精子氧化应激、能量代谢、细胞凋亡等相关通路，影响精子发生和成熟等重要生物学事件。

氧化应激指体内高活性分子如活性氧（ROS）和活性氮（RNS）产生过多，氧化和抗氧化失衡从而引起组织损伤。适量ROS对维持男性正常生殖功能起重要作用，影响精子获能、顶体反应等［34］。当机体抗氧化能力下降、ROS产生过多时则会对精子产生损伤，且精子膜富含花生四烯酸等多不饱和脂肪酸而更易遭受氧化应激损害。研究证实，精浆抗氧化防御减弱造成的氧化应激与男性不育相关［35］，谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸可结合生成谷胱甘肽而发挥抗氧化作用，体内牛磺酸、左旋肉碱等多种抗氧化物质的减少加剧了精子损伤。这些物质在改善精液质量中的作用已被大量研究证实，如抗细胞凋亡、抗氧化应激损害、提高精子活力、降低精子畸形率等［36-37］。ROS诱导脂质过氧化，破坏对维持精子功能至关重要的膜结构，降低卵子受精能力；亦可直接损伤精子核DNA，诱导畸形精子产生。此外，过量ROS损伤精子线粒体，ROS介导的精子蛋白DJ-1减少所致的线粒体功能障碍是弱精子症的重要机制［38］。同时脂质过氧化作用产生的脂质醛与线粒体电子传递链中的蛋白质结合，影响ATP合成并引发更多ROS产生。运用代谢组学技术评估氧化应激损伤已引起关注［39］，Agarwal等［40］在2019年首次提出了男性氧化应激性不育症MOSI的概念，对男性不育症进行病因学分类并建议将氧化还原电位检测纳入精液分析。

糖、脂质、蛋白质三大物质代谢改变引起的能量供应异常亦是不育症的重要机制，三羧酸循环是三大营养物质的共同代谢通路，是联系三大物质代谢的纽带，多种氨基酸最终均可通过三羧酸循环参与精子能量代谢（图2）。精子的主要能量来源是糖酵解和氧化磷酸化，丙酮酸、乳酸、左旋肉碱等作为糖酵解和氧化磷酸化通路上的重要分子，参与精子发生和精液质量调控。作为ATP产生场所，线粒体的功能状态愈来愈受到关注，线粒体膜电位改变、线粒体介导的细胞凋亡等均与精液质量密切相关［41-42］。生精是维持男性生育能力的关键过程，在此过程中睾丸支持细胞为生殖细胞提供能量和营养支持。丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和谷氨酰胺是支持细胞的重要能量底物［43］；乳酸不仅是生精细胞的重要能源底物，同时还可保护生精细胞，减少其凋亡［44］。丙酮酸与乳酸可相互转化，外源性添加丙酮酸可增加精子ATP产生、改善精子活力和运动性［45］。脂质是精子膜的重要组成部分，在生精过程中参与精子结构变化，同时脂质代谢又为精子提供能量。左旋肉碱是精子脂肪酸代谢的必需辅助因子，是脂肪酸进入线粒体内进行β-氧化、产生ATP的载体。据报道，附睾中左旋肉碱浓度比血液中高出近2000倍，附睾上皮细胞具有左旋肉碱主动转运系统［46］，左旋肉碱对不育症的治疗效果也已得到研究证实［47-48］。

信号转导指细胞针对外源信息所发生的细胞内生物化学变化及效应的全过程，是生殖领域的研究热点之一。代谢组学筛出的氨基酸、脂肪酸类衍生物等作为重要的信号转导分子，参与了男性生殖相关的多种生理过程的调节，其异常将最终引起精子功能障碍。如丝裂原活化蛋白激酶MAPK是细胞内重要的信号传递者，异常的花生四烯酸代谢可通过脂氧合酶、细胞色素P450和环氧合酶途径激活P38 MAPK通路而降低精子活力［21］。核苷酸衍生物cAMP、cGMP亦是重要的第二信使，cAMP、cGMP分别作用于蛋白激酶A、蛋白激酶C，调控酪氨酸磷酸化而参与精子获能［49-50］。关于精子细胞凋亡过程中信号转导的研究更是受到广泛关注。细胞凋亡对精子发生过程有重要意义，凋亡异常导致异常精子无法清除而造成无功能精子的产生。线粒体是介导细胞凋亡的重要细胞器，过量ROS可损伤精子线粒体膜、释放细胞色素C、激活caspase而触发凋亡［51］。ROS激活MAPK亚族中的ERK、JNK、p38信号通路而破坏血-睾屏障、促进细胞凋亡亦是精液质量受损的重要机制［52］。

四

展望

众所周知，代谢组学作为一种新兴的技术在男性生殖领域受到越来越多的关注，与基因组学、转录组学和蛋白质组学相比，被公认为更接近于疾病表型［53-54］。由于效率高、损伤小且样本多样化，代谢组学逐渐被应用于不育症的研究，多种小分子物质也已被鉴定为不育症的潜在生物标志物，为临床上男性不育症提供新的诊断方法和治疗靶点。因此，利用代谢组学技术量化各类差异代谢物来辅助精液常规分析、诊断男性不育症具有非常广阔的应用前景。然而，代谢组学作为一门新兴组学整体上仍处于初期发展阶段，目前应用代谢组学研究男性不育症的报道仍然有限，尚未受到代谢组学界的太多关注。此外，代谢组学研究样本的收集需进行严格控制，临床生物样本不易控制，样本保存条件、保存时间等因素的改变均可导致代谢谱的变化而影响实验结果。同时代谢组学分析仪器复杂、操作繁琐、缺乏标准通用数据库且很多代谢通路尚不明确，筛出的差异代谢物种类繁多，从实验室到临床的进展仍然缓慢，还需要与基因组学、蛋白质组学、转录组学相结合，以全面了解病因和分子机制，更好地服务于临床。多种生物标志物组合或将提高代谢组学在男性不育症方面的诊断能力。

参考文献（略）