【摘　要】：

目的　近年来男性不育症的发病逐年上升，精子质量出现明显下降的趋势，男、女性不孕不育的比例由先前 3 ：7 上升到 5 ：5，男性不育日益得到相关研究者的重视。本文着重研究生殖道解脲支原体（UU）,衣原体感染对男性不育患者精子DNA完整性和精液常规参数的影响。

方法   2017年-2018 年本院男科实验室检查和生殖医学中心就诊的253 例男性不育症患者，通过荧光定量 PCＲ 检测精液 CT、UU 感染情况，根据检测结果分为 I组CT 阳性组（63例）、II组UU 阳性组（60例）、 III组CT+UU 阳性组（62例）和IV组阴性对照组（68例）。分别进行DNA 断裂指数（DFI）、精子浓度、存活率和精子正常形态，弹性硬蛋白酶等指标的检测.

结果　I组 II组 III组的精液量、精子正常形态百分率、精子活力、 前向运动、 存活率与IV组比较， 差异有统计学意义(P＜0．05), II,III 组的DFI与IV比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。II（920.6±751.2 ng /ml）,III（1241.8±1016.5 ng /ml） 组的弹性硬蛋白酶与IV（256.5±172.6 ng /ml）比较，差异有统计学意义(P＜0．05)

结论　单独及合并感染对男性精液参数及精子功能有一定影响，是引起男性不育的原因之一。

关键词：解脲支原体生物群男性不育精子参数活性氧损伤

Effect of male reproductive tract infection on

semen quality and DNA fragmentation indexes

Abstract  Recent years have seen a rise of male infertility, mostly caused by the decline of sperm quality. The ratio of infertile males to infertile females has escalated from 3:7 in 2013 to today’s 5:5, turning human infertility into the research focus of reproductive medicine. This article aimed to clarify the effect of reproductive tract infection by ureaplasma urealyticum(UU) and chlamydia trachomatis (CT) on the DNA integrity and routine parameters of infertile males’ sperms. A total of 253 infertile males treated in the Andrological Laboratory Examination and Reproductive Medicine Center in our hospital were analyzed. PCR was used to examine the infection by CT and UU. After fulfilling the eligibility criteria, we evaluated the semen analyses and biochemical data of 253 men. According to results of PCR, all the subjects were divided into four groups: group I (CT positive, 63 cases), group II (UU positive, 60 cases), group III (CT positive and UU positive, 62 cases), and group IV (no infection, 68 cases). Examinations were conducted in these four groups to test DNA fragmentation index (DFI), sperm count, vitality and morphology, elastinase level, seminal plasma malondialdehyde (MDA), and total antioxidant capacity (TAC). A retrospective study was performed. Compared to group IV, three groups (group I, group II and group III) showed difference in semen volume, proportion of sperms with normal morphology, sperm motility, progressive motility, and vitality (P<0.05). Compared to group IV, group II and group III showed difference in DFI (P<0.05). Compared to group IV, group II and group III showed difference in elastinase level (P<0.05)。Male reproduction infection by UU, CT, or their combination can decrease sperm function and lead to infertility.

【关键词】

DNA 断裂指数；解脲支原体;沙眼衣原体;精液参数

DNA fragmentation index, ureaplasma urealyticum, chlamydia trachomatis, semen parameters,

生殖道感染与不孕不育密切相关，以非淋菌性尿道炎最为常见， 主要是支原体和衣原体感染[1] 而男性生殖道感染是影响男性生殖健康的一个重要因素， 据报道约 15%的男性不育与其有［2］。支原体与衣原体导致的非淋菌性尿道炎在男性如生殖道、附睾、 前列腺和睾丸相应感染部位较多［3］， 对精液质量、 精子发生、精卵结合及妊娠结局等方面有一定影响, 而随着临床上对支原体和衣原体的检测方法一直不断的改进， 由于扩增的方法不同， RNA 检测的拷贝数大于 DNA 检测， 使得其灵敏度更高,可以使临床更特异, 更精准地早期检出［4］.同时,随着生殖医学等的不断发展，精子DNA碎片化检测也被广泛用于评价精子质量和预测生育能力（传统的精液常规由于受多种因素的影响，在临床上存在一定局限性）［5-6］。男性精液由精浆和精子组成，精浆为精子的发育、成熟及获能提供营养环境，在受精过程中起递质作用; 精浆成分变化可反映男性睾丸及附睾的代谢状态及生殖道附属腺体的分泌功能，在评价男性生殖功能方面具有重要的临床意义[7]。Ziyyat 等［8］ 发 现 ， 精子 中 的中性粒细胞主要来源于附睾及前列腺，其中以附睾产生较少对清子的质量产生影响。世界 卫生组织 ( WHO) 规定[9].精液中白细胞数大于 1 × 106 /ml 可诊断为白细胞精子症，白细胞精子症在男性不育症中占的比例逐年增高，精液中白细胞及相关因子如何影响精液质量及男性不育，目前尚不十分清楚[10-11]。鉴于国内很少见男性生育力缺陷方面相关DNA碎片指数指标与生殖道感染支原体,衣原体联合方面的研究报道。本次研究旨在研究男性生殖道感染不孕方面患者的精子DFI 与传统精液参数之间的研究,以讨论不同感染组之间的关系。

1资料与方法

1.1基本来源

来自 2017年-2018 年本院男科实验室检查和生殖医学中心就诊的253 例男性不育症患者， 年龄18-35 岁，平均 3年。

纳入标准：

1、无外伤及遗传性疾病家族史（如：克氏综合 征、Y染色体缺失等)，不伴有泌尿生殖系统（如：精索静脉曲张、隐睾、前列腺炎、附睾炎） 等外科疾病。

2、 检查未发现明显的睾丸 、附睾及输精管结构异常 ，无精症患者被排除在外

3、无性功能障碍史，排除女方不孕及其他影响受孕的相关疾病

4、未有特殊用药史(如激素类、细胞毒药物)和相关特殊职业暴露史( 如铅接触、高强辐射、化工、高温等)。

不育症诊断标准:夫妻同居 12 个月以上， 正常性生活， 未采取任何避孕措施， 未使女方受孕者［1］。

分组：根据 CT- DNA UU- DNA 检测结果分为 CT阳性组 UU 阳性组 CT+UU 阳性组和阴性对照组，各组年龄 不育时间等比较差异无统计学意义(P＞0.05)， 具有可比性

Figure 1: The flowchart of baseline characteristics of par ticipants

1.2标本采集

1. 2. 1 精液标本采集

所有研究对象取精液前禁欲3 -5 d， 手淫法留取标本于无菌的塑料容器中， 置37℃孵箱液化记录禁欲时间，完全液化后行精液常规检测每份精液标大于2.5mL， 其中 1.5 mL 精液用于精液常规检测，其于量的精液用于精子 DNA碎检测。另用无菌管留取精液标本进行 CT- DNA、 UU- DNA 检测.

1.2.2精液常规分析

按照世界卫生组织《男性不育标准化检查与诊疗手册》第五版行精液分析，西班牙spanish CASA system精子质量检测系统及配套试剂.分别记数精液总数 ,精子浓度,存活率,活力等指标， 精子形态学分析采用巴氏法染色， 记录精子的正常形态率， 为了反映精子的多重缺陷， 分别计算每份标本的精子畸形指数( sperm deformity ibdex， SDI) .  

参考值

(I)  1.精液量: ≥ 1.5ml；2.  PH 值: ≥ 7.2；3.  液化时间:<60min；4.精子总数:≥39*106/一次射精；5.精子密度: ≥ 15*106/ml；6.精子活力:活力 ≥ 40%

；7.精子活动率:活动率≥50%；8.精子形态学:正常形态精子百分率≥4%；9.粘稠度:精液拉

丝长度<2cm。

(II)正常快速前向运动的精子：a级和稍慢速向前运动的精子b级（a级+b级）≥32%或a级精子≥25%。

(III)弱精子症

1/轻度弱精子症：是指a级+b级精子≤50%，但≥30%或a级精子≤25%，但≥10%.

2/中度弱精子症：是指a级+b级精子≤50%，但≥30%，其中a级精子≤10%.

3/重度弱精子症：是指b级+c级精子数量≤30%，其中a级精子为零。

1.2.3精子DNA完整性测定

精子 DNA 完整性检测：SCD （sperm chromatin dispersion，SCD）法采用精子 DNA 碎片检测试剂盒( 深圳博锐德生物科技有限公司) ，将精子悬液与琼脂糖 混合铺于载玻片上，酸处理后溶解细胞去除核蛋白， 用染色剂染色，最后用显微镜观察结果。根据精子 DNA 产生的光晕进行评估，正常的精子 DNA 产生 扩散的光晕，而损伤的精子 DNA 则不产生或产生很 小的光晕。取多个视野计数 500 个精子，记录不同光晕精子所占比例，计算精子的 DFI( DNAfragmentation index， DFI) 。

精子 DNA 碎片判定标准为: 精子头部仅产生较小的光晕或无光晕， 单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的 1 /3 精子。DNA 碎片率( %) =存在 DNA 碎片精子数 ÷被观察精子总数 × 100%.小于25%为正常范围.

1.2.4精液精浆弹性硬 蛋白

使用 RT - 6000 酶标分析仪 进行精浆生化检测，按照深圳华康生产的精浆弹性硬 蛋白酶定量检测试剂盒。结果判断: ( 1) 精 浆弹性硬蛋白酶 ＜ 290 ng /ml 为正常，290 ng /ml ～ 1 000 ng /ml为隐性感染，＞ 1 000 ng /ml 为确诊感染。

1.2.5试剂 CT- DNA、 UU- DNA 检测

试剂盒由中山达安基因公司提供， 严格按照说明书操作，CT- DNA 和 UU- DNA 采用荧光定量，PCR法检测(拷贝数大于103copy /ml 判定为阳性)

1．3 统计学方法

应用 SPSS 19．0 软件进行统计分析，率的比较使用卡方检验。计量资料采用均数±标准差( x±s)表示， 多组间比较采用方差分析， 两两组间比较用 LSD- t 检验， 检验水准: a= 0．05， 双侧检验。

2.结 果

2.1 三组间精子活力 、前向运动、 存活率比较

注：I为：CT 阳性组  II 为：UU 阳性组 III为：CT+UU 阳性组 IV:阴性对照组

a：Compared with Group IV P<0.05;

b ：Compared with Group I ,II. P<0.05

I组、 II组、 III组的精子活力、 前向运动、 存活率与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。III 阳性组的精子活力、 前向运动、 存活率与I组、 II组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。见表一。

2.2三组间精液量，精子浓度 精子正常形态百分率比较

注: I为：CT 阳性组  II 为：UU 阳性组 III为：CT+UU 阳性组 IV:阴性对照组

a：Compared with Group IV P<0.05;

I组 II组 III组的精液量、 精子浓度、 精子正常形态百分率与IV组比较， 差异有统计学意义(P＜0．05)。但III 组的精液量、 精子浓度、精子正常形态百分率与 I组,II组比较无统计学意义(P>0．05)。

2.3三组间精子DFI、精浆弹性硬蛋白酶比较

注: I为：CT 阳性组  II 为：UU 阳性组 III为：CT+UU 阳性组 IV:阴性对照组

II,III 组的DFI与IV比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。

a：Compared with Group IV P<0.05;

2.4  三组间精子MDA、TAC比较

注: I为：CT 阳性组  II 为：UU 阳性组 III为：CT+UU 阳性组 IV:阴性对照组

   a:Compared with Group IV P<0.05;

3讨论

3.1生殖道的支原体（mycoplasma）和衣原体(chlamydia）感染作为最常见的性传播疾病（sexuallytransmitted disease，STD）之一，统称为非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)。生殖道支原体、衣原体感染导致不孕不育的发生得到大部分学者认可,但感染者大部份患者并无症状[12-13]。流行病学调查发现， 亚洲地区国家中， 生殖道支原体感染在伊朗的流行率较高，印度为6．0%， 越南比较少仅为 0.8%; 在欧洲， 流行率在1.1% - 7.1% ［14-16］.在中国，Zhang 等在对深圳市人群的流行病学调查中发现， 生殖道衣原体的总流行率为17.7%， 而在过去3 个月的性行为中没有持续使用避孕套和有其他性传播疾病的人，其感染率大大增高［17］。除此之外，研究指出，当生育期的男性生殖道感染支原体、衣原体时，会对男性精子造成影响，使精子发生液化时间延长，精子质量下降，导致男性不育症的发生 [18]. 本研究观察了 253 例不育患者， 对各组的精液常规参数（包括DFI）进行比较，结果显示，在男性不育患者中，各阳性组与阴性对照组相比存在明显差异，提示 CT、UU 感染可一定程度上对男性精液质量下降产生影响。这与邓国明等报道基本一致， 同时精子 DNA 完整性有不同程度的损伤，DNA 碎片率增加，与 Gallegos等的结果报告相符[19-21]。

3.2男性精浆中感染UU时，通过干扰精子发生、影响精子代谢等多方面对精子造成影响，对精卵结合及生殖道局部免疫状况产生一定程度改变[22-24]。由于UU没有完整细胞壁结构，感染机体后并不进入组织和血液，而是寄生在生殖道粘膜细胞或生殖细胞上，靠汲取所寄生的细胞获取营养。被粘附的生殖道上皮细胞，吸收营养后细胞功能紊乱，精子生成的内环境失衡，生精作用受影响，精子生成数量减少。当UU粘附在精子头部和体部时，吸收精子细胞的营养物质，对精子的生成与代谢产生干扰作用，并造成精子运动能力降低.还可使精子的流线型线条产生改变[25]。UU生长需要胆固醇和尿素，代谢中汲取营养的过程中也一并会释放有害的过程产物(如过氧化氢、氨等)会引起精浆的理化性质改变，使精子生成的必须元素如果糖、锌和锰含量下降，干扰了精子的正常代谢。此外，精浆弹性硬蛋白酶检测容易发现生殖道感染，当存在男性生殖系统感染时， 该酶被大量分泌至细胞外， 与其他氧化物发挥局部抗炎性反应。由于弹性硬蛋白酶是一种可溶性蛋白酶， 在精液中均匀分布， 对诊断男性生殖系统感染比精浆白细胞更加准确[26]。因此， 精浆弹性硬蛋白酶是男性生殖系统感染， 特别是隐性感染的重要诊断指标之一.改指标检测也是一种灵敏度、特异度均较好的炎症指标,本研究II,III 组与IV比较，差异有统计学意义，提示生殖道感染影响男性不育患者精囊和附睾的腺体分泌功能，影响男性不育患者的精液量和精子质量。同时精子细胞外的p H值升高，精子细胞内外的渗透压发生改变，破坏了精子生存的外环境，使精子死亡率增高。同时进而也可引起男性的性腺及附属性腺的炎症表现。

国内外有很多研究结论指出，生殖道CT感染也是男性不育的因素之一[27],其感染引起的炎症作用(会产生炎症因子，细菌、白细胞)与致炎症因子共同相户作用对精子发生与成熟(会影响精子发育，导致精子密度减低，活力减小)的均带来负面影响[28]。有研究指出，CT的感染比UU感染对精子质量参数的影响更严重，尤其是在两者混合感染的患者中[29]。CT感染男性泌尿生殖道后，其感染代谢产生大量磷脂酶A2，分解精液中的花生四烯酸产生前列腺素，引起炎症反应，导致尿道炎、附睾炎、睾丸炎等[18]。CT可进入精子细胞内，使精子膜和顶体膜破坏，使精子的活动能力下降，并抑制精子对卵细胞透明带的附着与穿透，使受精作用减弱，降低男性的生育能力（精子活力）。与UU相同，CT也可诱导精子自身免疫反应产生As Ab，影响精子功能和受精作用，导致男性不育的发生。支原体、衣原体对精子质量的影响机制尚未明确，其本上是以上 相关阐述的内容.

3.3精子DNA的完整性是判断精子质量的有效依据，近期文献研究表明精子DNA完整性不仅会严重影响到精子的受精能力，受精后原核的形成，而且可能导致流产、后代先天畸形或者有某些遗传性疾病[30]。支原体、衣原体感染导致精子DNA碎片化程度明显增加，目前认为其中最主要的可能机制是感染导致的氧化应激，该反应可以直接损伤精子细胞或通过凋亡机制导致DNA碎片化增加,氧化应激还可以影响细胞的染色质组装、改变蛋白表达, 而当跨膜转运蛋白和膜受体受影响又可能导致细胞离子通道的改变[31],有些学者的实验研究中发现，支原体、衣原体的感染对男性精子的影响并不直接体现在精子的浓度和活动力的改变，而是体现在精子的DNA碎片化指数增加[32-33]。国内外均有报导，在研究男性生殖道支原体或衣原体感染时，发现到该两种病原微生物在影响男性生育力方面并不通过精子的常规参数,或者并没有对常规参数造成显著差异的影响，而是通过精子的DNA碎片化增加等方面[34]. 本研究结果表明UU 阳性组和CT+UU 阳性组分别与阴性对照组相比较，差异有统计学意义.与研究相一致[35].

3.4同时，自由基是氧化反应的产物，活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）最为重要。精浆中的抗氧化剂可以保护精子DNA的氧化损伤，少量适当的ROS有助于精子获能和顶体反应；过量的ROS超过本身的清除能力和防御能力时，则导致精子DNA双链断裂、产生单链，其原理是ROS可能通过直接氧化精子DNA碱基，也可能通过脂质过氧化产物与DNA的共价结合，引起精子DNA链断裂，从而导致精子的生物结构受破坏，精子DNA损伤。如果精子DNA受损，又会更容易受到ROS的攻击，两者恶性循环，最终使精子DNA损伤逐渐加重。同时精液中增多的白细胞可以刺激人类精子产生ROS，这种刺激可以通过细胞-细胞接触或白细胞产生的可溶性产物等多种途径介导损伤精子DNA结构的完整性[36]。男性精液存在着抗氧化系 统 ,丙二醛（malondialdehyde， MDA）为常见的活性氧检测指标，而总抗氧化能力（TAC）为抗氧化的检测指在。本次研究中， 我们初步发现对照组精浆中 MDA 水平显著低于前面两组，而精浆中的 TAC 水平对照组则明显高于其它几组,说明精液脂质过氧化反应产生过多的MDA， 同时 TAC 的下降， 可能导致精液发生氧化应激反应， 破坏精子膜结构，与前述原理表述基本相一致[37-38]。Ni 等和符浩等研究表明， 精索静脉曲张患者精子 DNA 损伤可能与 ROS 有关， 而Greco等和商学军等均报道了使用抗氧化剂可以降低精子DNA 碎片率， 这也另一角度说明精浆中 ＲOS与精子 损伤有一定的关系[39-40]。

本研究存在一些局限性。本次研究的病例数比较少。总之， 支原体, 衣原体作为性传播疾病的重要病原体， 可以影响男性生殖系统的多个器官， 并能直接或间接影响精子质量， 对男性的生育力产生不利影响. 生殖道 UU、CT 感染对导致男性少和（或）弱精子症、等的不孕不育机制尚未完全清楚，值得进步探讨。

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